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    技術文章

    細胞培養與顯微鏡點擊次數:67 發布時間:2021-02-22

    哺乳動物細胞培養系統可以根據幾種不同的特征進行細分。上一期我們介紹了其顯著的分類特征——形態,而另一個區別就是細胞類型。根據其來源,細胞可以細分為永生化細胞,原代細胞和干細胞(包括患者特異性細胞)。

     

    細胞類型

    永生化細胞

    使用中常見的細胞類型可以追溯到永生化細胞,這些細胞要么來源于腫瘤組織,要么已被癌基因轉染。由于其惡性背景,它們會無限分裂。這以特性使它們非常適合作為細胞系進行培養,而且功能強大且價格適中。其他常用的永生化細胞系是HEKA549JurkatMDCKCOSVero細胞。

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    原代細胞

    原代細胞直接取自活體組織。為了培養,將原始組織片段通過酶、化學或機械方法解離為單個細胞,然后將其接種到培養瓶中。原代細胞比永生細胞系更難培養,他們的生存率很低,而且許多沒有分裂。此外,它們的基因操作可能具有挑戰性。盡管如此,還是值得付出努力的,因為它們的特性更接近自然細胞。換句話說,用原代細胞獲得的實驗結果可以更有信心地轉化到體內。

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    干細胞

    干細胞是人體的原始細胞。它們可以從非專能細胞分化為具有特征和功能的組織細胞。因此,它們可以分為幾類。多能干細胞(pluripotent stem cells)是用途廣泛的干細胞,能夠分化為任何種類的人體細胞。與多能干細胞相比,專能干細胞(multipotent stem cells)顯示出有限的分化范圍。雙能干細胞只能發育成兩種不同的細胞類型。干細胞除了分化成特殊的細胞類型外,還可以自我更新。

     

     

    細胞培養模式

    上面提到的所有細胞類型都擁有不同的生長方式。例如,一次細胞培養可以僅由單個細胞類型或多種細胞類型組成,并且可以進行2D或3D培養。

     

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    另一方面,2D單培養也是維持細胞生長最人工的方式,主要原因有兩個:細胞在生物體中呈3D生長,而且它們并不會與其他類型細胞分開生長。

     

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    想要進入3D世界,細胞生物學家必須運用某些技巧。其中之一是消除細胞粘附在培養基上的機會,可以通過使用帶有特殊涂層的細胞培養容器、使用凝膠培養基(例如Matrigel™),或通過懸滴培養細胞來實現。這種物體更接近更真實組織,包括天然組織中常見的代謝和增殖梯度。這也是球狀體通常被用于藥物開發的原因之一,因為它們模擬了血管腫瘤。

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    在更逼真的3D細胞培養的另一種方法是使用支架。可以利用由金屬,聚合物或陶瓷制成的培養基來幫助細胞蠕變成三維形。這些支架可以用作臨床植入,也可應用于實驗室。

     

    另一個非常真實的細胞培養組織是基于在細胞外基質凝膠內部存在不同生長因子的情況下培養的干細胞。根據生長因子的類型(eg:FGFEGF等)和其他組分,干細胞會發育成稱為類器官的微型器官。

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    生長條件

    哺乳動物細胞培養必須保持在37°C,通常在具有各種形狀和大小的一次性塑料容器中進行培養。

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    其中最小的是96孔板,通常用于篩選應用。

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    另一方面,有一些細胞工廠被用于大規模生產疫苗或蛋白質。

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    與細胞培養物一起工作意味著在無菌條件下操作,例如在超凈工作臺上并使用抗生素。而且,必須向提供包含營養物和生長因子的適宜培養基,包括:葡萄糖、丙酮酸鈉、氨基酸、維生素、無機鹽、水、由于其不穩定性,因此經常添加氨基酸谷氨酰胺。蛋白質,脂質或生長因子通常添加在胎牛血清中補充。

     

    細胞的代謝產物使培養基酸化。因此,緩沖液系統可用于維持pH穩定(?7.4)。通常通過酚紅指示劑監測pH,并使用碳酸氫鹽(HCO3-)緩沖液,它們結合H+的能力取決于周圍的CO2水平。因此,通常向細胞培養箱提供CO2HEPES緩沖液獨立于CO2,通常用于無法進行CO2孵育的活細胞顯微鏡應用中。

     

    顯微鏡

    說到用于細胞培養的顯微鏡,其必須具備某些基本特征。哺乳動物細胞在液體培養基中培養就意味著顯微鏡必須具有倒置配置。在這種配置中,物鏡安裝在培養皿下方,培養皿放置在顯微鏡載物臺上,聚光鏡安裝在上方。只有通過這種設置,物鏡才能足夠接近樣品。此外,通過這種構造,研究人員在樣品周圍具有更多的自由空間。

     

    想要大致了解細胞培養的總體狀況,放大倍率為100x~200x足矣。哺乳動物細胞固有的低對比度要求顯微鏡提供特定的對比度方法。相差和調制相差是常見的,而微分干涉(DIC)與通常用于細胞培養的塑料容器不兼容。

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    借助這種基本設備,研究人員可以判斷細胞數量和融合度。根據融合情況,將細胞傳代培養至其他容器中。

     

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